细菌生物被膜相关感染的特点与防治[药学保健论坛|反冲力资料库|药学服务区|网络药学|执业药师|处方点评|药物警戒|临床药学|求医问药|药事管理|]

解放军总医院临床药理研究室王睿综述认为，随着现代医学高科技的发展，新型生物材料的应用日益增多，生物材料相关感染发生率亦有逐年上升的趋势，从而限制了这些新技术的推广应用。国外近年对生物材料相关感染和某些慢性呼吸道感染反复发作及难以控制的病因探讨中，提出了细菌生物被膜（bacterial biofilm,BF）病的概念。　　BF是细菌为适应自然环境而形成的，系细菌吸附于生物材料或机体腔道表面，分泌多糖基质，将其自身包绕其中形成的膜样物。人们发现生长于BF中的细菌，无论其形态结构、生理生化特性及对抗菌药物的敏感性等都在浮游生长的细胞显著不同，致病特点也不同。BF可以保护细菌逃逸宿主免疫和抗菌药物的杀伤作用，使游离菌致死的抗菌药物剂量往往对BF中的细菌无效，同时应用低于致死量的抗菌药物又容易使细菌产生高度耐药性，导致临床感染的难治性，使治疗更为棘手。　　 BF相关感染的类型　　1.生物医学材料相关感染有逐年上升的趋势　　根据流行病学调查，导尿管相关泌尿系统感染发生率为92%～93%，约占院同感染的40%；心脏外科生物材料（人工瓣膜）置入术合并感染发生率为33.3%；90的机械通气患者气管插管处有细菌定植并发复发生感染；此外，大静脉导管、伤口引流管、人工关节置入等相关感染的发生率亦较高。　　2.BF相关慢性感染有资料表明　　铜绿假单胞菌易吸附于粘膜表面形成BF，这在肺囊性纤维化（CF）、弥慢性泛细支气管炎（DPB）患者中常见；其它感染性疾病如慢性骨髓为也可能有BF形成。　　 BF感染的难治性　　1.抗菌药物难以渗透　　在BF导致的感染性疾病中，由于BF可以形成耐药屏蔽，这样就使能到达BF溶部的抗菌药物数量大大地减少，难以发挥抗菌作用。　　2.局部免疫反应低下　　细菌能够刺激多形核粒细胞产生，并可使浮游细菌减少。但由于BF被藻酸盐包围或掩饰，从而激活中性粒细胞能力下降。　　3.易反复发作　　这些深部细菌分裂迟缓对抗菌药物的通透性较低，加之对抗菌药物不敏感，很难彻底清除。这些BF深处的细菌就成为感染再发的根源，这就是BF导致临床上难治性感染的原因。　　三、BF相关感染的防治措施　　BF导致的感染性疾病治疗极为棘手，目前主要通过以下向方面治疗：①预防BF形成；②对于已形成稳态的生物被膜则需用能够透过BF的强有力的抗菌药物治疗；③酶的协同作用。　　1.预防生物医学材料相关感染　　临床上各种体内插管，如导尿管、大静脉导管、人工关节、人工瓣膜、气管插管表面形成BF，其致病菌主要是金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌，这就要求我们必须严格进行无菌操作，控制致病原。已有实验表明在尿路感染中，应用抗感染导管（表面镀银的导尿管）确有预防感染及生物被膜形成的作用；用含钛材料制成的导管具有显著抑制大肠杆菌和铜绿假单胞菌的作用，但其确切机制还不清楚。　　2．药物防治　　对已形成稳态的BF则需用能透过BF的抗菌药物来治疗。在BF开始形成的72小时内由于BF未形成稳态，对各种抗菌药物相对比较敏感，治疗效果相对较好。这就是提示我们对于假体器械所引起的感染初期，可应用抗菌药物以阻止或破坏细胞BF的形成。粘液型铜绿假单胞菌藻酸盐的合成可以被米诺环素、妥布霉素、林可霉素及大环内酯类药物抑制，非粘液型的铜绿假单胞菌多糖物质合成可能被大环内酯类、林可霉素等抑制。氟喹诺酮类药物可以穿透细菌细胞外多糖，对生长缓慢的细菌有一定的杀菌作用。大环内酯类药物与氟喹诺酮类药物联合应用可抑制细菌细胞外多糖，抑制导管表面BF的形成。　　3. 蛋白酶的作用 < br> 　　已知蛋白水解酶和蛋白抑制剂在体外有降低或抑制制某些细菌活性的作用。有人用不同蛋白酶对BF进行实验研究，结果发现齿型多肽酶活性最大，由于它可提高抗菌药物渗透感染部位，目前被作为抗炎辅助药物用于试验性治疗中。

细菌生物被膜与慢性下呼吸道感染解放军总医院呼吸科刘又宁

细菌生物被膜是指细菌黏附于固体或有机腔道表面，形成微菌落，并分泌多糖蛋白复合物将自身包裹其中而形成的膜状物。目前有学者认为，细菌生物被膜形成是导致某些慢性感染反复发作难以治愈的重要原因，其机制包括：１　阻滞抗生素的渗透；２　吸附抗生素灭活酶，促进抗生素水解；３　被膜下细菌代谢低下，呈“亚冬眠状态”，对抗生素的敏感性降低；４　阻止机体免疫系统对细菌的清除，产生免疫逃逸现象，减弱机体免疫力与抗生素的协同杀菌作用。

临床上容易形成生物被膜的致病菌主要有铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌等。铜绿假单胞菌容易吸附在体内黏膜表面形成生物被膜，这在弥漫性泛细支气管炎ＤＰＢ　、囊性肺纤维化、支气管扩张及慢性阻塞性肺疾病ＣＯＰＤ　中较为常见，虽然抗生素有一定的临床疗效，但是铜绿假单胞菌总是难以彻底清除，电镜观察可见病变部位有细菌生物被膜形成。金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌则更容易在各种生物医学材料如导尿管、大静脉导管、气管插管等　的表面形成生物被膜，导致所谓生物医学材料相关感染。

生物被膜相关的感染性疾病的治疗十分棘手，目前主要有两种策略：１　抑制生物被膜的形成；２　在治疗过程中尽量选用能透过生物被膜的杀菌剂。在临床常用的抗生素中，氟罗沙星、加替沙星等喹诺酮类药物对细菌生物被膜有较好的渗透性，对生物被膜下生长缓慢的细菌也有的杀菌作用；克拉霉素、阿齐霉素、罗红霉素等大环内酯类药物可抑制细菌生物被膜的形成，与氟喹诺酮类药物联用时，可提高后者对细菌生物被膜的渗透性和对被膜下细菌的杀菌活性。此外，人们还尝试采用抗藻酸盐血清或藻酸盐单克隆抗体　、蛋白水解酶来抑制细菌生物被膜的形成。

细菌生物被膜与难治性感染性疾病

中华结核和呼吸感染 1999年第3期第22卷综　　述

作者：方向群　刘又宁

单位：100853 北京，解放军总医院呼吸科

　　生物被膜（biofilm)的形成是细菌为适应自然环境而采取的一种生存策略。生物被膜中的细菌无论其形态结构、生理、生化特性还是对抗菌药物的敏感性都与普通浮游（planktonic）生长的细菌有显著的不同，致病特性也不同，是造成难治性感染性疾病的重要病因之一。为此，我们就细菌生物被膜（bacterial biofilm）的形成、耐药机制、致病特点及其防治措施加以综述，为临床防治由细菌生物被膜导致的感染提供参考。

　　一、细菌生物被膜的形成

　　生物被膜是微生物为适应自然环境而形成的。例如：河流中的微生物就能吸附在岩石表面，这种吸附作用更有利于自身的生存。对于细菌来说，它可以分泌多糖蛋白复合物(glycocalyx)将自身粘附于各种物体的表面，细菌在所吸附的物体表面不断分裂就形成了细菌生物被膜。使病原菌可以在体内插管表面及粘膜表面形成生物被膜［1］。

　　临床上细菌生物被膜主要形成于各种体内插管，如导尿管、大静脉导管，气管插管等的表面，从而导致导管相关感染（catheter related infection），在这种情况下，来源于患者及医护人员的金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌是主要的致病菌［2］。铜绿假单胞菌则容易吸附于体内粘膜表面而形成生物被膜，这在肺囊性纤维化及慢性肺部疾患如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、弥漫性泛细支气管炎中较为常见［3］，其他感染性疾病如慢性骨髓炎的病灶中也有生物被膜形成［4］。在人体内部形成的细菌生物被膜中还混有血细胞，纤维蛋白等物质。目前通过激光共聚焦显微镜可以原位（in situ）观察活体细菌生物被膜，发现细菌生物被膜并非以前所认为那样只是一层致密的膜，而是在细菌生物被膜内有着相互交通的水通道（water channels），这些通道足以让细菌生长需要的营养物质进入细菌生物被膜的深层、代谢废物也可以经此排出，抗菌药物也可以由此通道进入细菌生物被膜的深层，因此原先仅把细菌生物被膜看作物理屏障的观点过于简单化，这些发现对研究细菌生物被膜的耐药机制有着重要的意义［5］。

　　二、细菌生物被膜导致难治性感染的机制

　　在细菌生物被膜导致的感染性疾病的病灶中，一部分细菌以浮游生长的形式存在，而另一部分细菌则以生物被膜的形式存在，有效浓度的抗菌药物能迅速地杀灭浮游生长的细菌和生物被膜表面的细菌。但是生物被膜细菌产生多糖蛋白复合物，一方面可以通过氢键、Van der waals力、共价键吸附一部分抗菌药物，另一方面吸附于生物被膜多糖蛋白复合物的抗菌药物灭活酶，如β内酰胺酶也可以灭活一部分抗菌药物，这样就使直接接触细菌的抗菌药物大大地减少［6，7］。此外生物被膜中的细菌分裂迟缓，对抗菌药物不敏感［8，9］。再则，由于浮游生长的细菌和生物被膜表面的细菌被杀灭，患者的临床症状得到缓解，临床医生就可能终止抗菌治疗，没有抗菌药物抑制的生物被膜中的细菌，就可能成为感染再发的根源，造成临床上某些感染迁延不愈［1］。

　　也有体外实验表明，细菌形成生物被膜后可以逃避机体的免疫作用。这表现在细菌形成生物被膜后由它诱导的补体转化及中性粒细胞呼吸爆发都显著地降低。这就有可能产生免疫逃逸作用，使细菌不易清除［10，11］。

　　三、细菌生物被膜的致病特点

　　一般来说细菌生物被膜导致的难治性细菌感染性疾病有以下特点：

　　1.病灶局部的炎症反应不很强烈，感染有相互转化的静止期和发作期；

　　2.抗菌药物治疗起初可能有效，但以后治疗常常失败；

　　3.致病菌主要是来自皮肤和周围环境中的致病菌如铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌［1］。

　　铜绿假单胞菌是慢性呼吸道感染的重要致病菌之一，它的粘液型菌株可以产生藻酸盐，而非粘液型菌株可以产生其它种类的多糖蛋白复合物形成细菌生物被膜。比较典型的病例是肺囊性纤维化合并肺部感染，虽然抗菌药物有一定的临床疗效，但是铜绿假单胞菌总是难以彻底清除，电镜观察可见病变部位有细菌生物被膜形成。其中藻酸盐是重要的组成成分，它可以使细菌牢固地粘附于肺上皮表面形成生物被膜，一方面可以抵御单核-巨噬细胞的吞噬作用，另一方面可以抵制抗菌药物的杀灭作用。进一步的研究表明，铜绿假单胞菌藻酸盐的合成是由细菌alC和alD基因控制的。有实验表明，铜绿假单胞菌和硅胶膜表面接触后，可以激活控制藻酸盐合成的基因组，促使细菌合成大量的藻酸盐。所以细菌生物被膜的形成是受严密的基因调控的［12］。

　　四、细菌生物被膜感染的防治

　　细菌生物被膜导致的感染性疾病治疗极为棘手，目前主要通过以下两个方面来防治：

　　1.抑制生物被膜形成；

　　2.对于已经形成稳态的生物被膜，则需用能够透过生物被膜的杀菌剂来治疗。

　　国外有研究表明，低于最低抑菌浓度的某些抗菌药物；可以通过抑制细菌的多糖蛋白复合物产生来抑制细菌生物被膜的形成［13］。粘液型铜绿假单胞菌藻酸盐的合成可以被米诺环素、妥布霉素、林可霉素及大环内酯类药物抑制，而哌拉西林、头孢他定、氧氟沙星则不能抑制，非粘液型的多糖蛋白复合物合成可以被大环内酯、林可霉素抑制。这就提示，临床上可以用小剂量的大环内脂类、林可霉素类抗菌药物来防治细菌生物被膜导致的感染［14，15］。

　　有资料表明，在细菌生物被膜开始形成的72小时内，由于细菌生物被膜未形成稳态，对各种抗菌药物相对比较敏感，治疗的效果相对较好，以后的治疗效果就比较差［16］。虽然如此，在近期的研究中有学者认为，对铜绿假单胞菌联合应用大剂量的哌拉西林和妥布霉素或对静止期细菌有杀灭作用的抗菌药物如亚胺培南、环丙沙星对已形成稳态的铜绿假单胞菌生物被膜仍有一定的疗效，但不可能彻底清除细菌生物被膜［17，18］。

　　总之，由细菌生物被膜导致难治性细菌感染的防治仍是临床上一个亟待解决的问题。目前应用的抗菌药物都不能彻底清除细菌生物被膜，这也给抗菌药物的研制提出了新的要求，随着细菌生物被膜生理、生化研究的不断进展，人们有可能发现新的途径来防治细菌生物被膜导致的难治性感染性疾病，开辟现代抗菌药物治疗的新途径。

　　参考文献

　　1　Costerton JW,Chen KJ,Gessey GG, et al. Bacterial biofilms in nature and disease. Annu Rev Microbiol,1987,41:435-464.

　　2　Khardori N, Yassien M. Biofilms in device-related infections. J Ind Microbiol，1995, 15:141-147.

　　3　Kobayashi H. Biofilm disease: its clinical manifestation and therapeutic possibilities of macrolides. Am J Med, 1995, 99:26-30.

　　4　Gristina AG,Oga M,Webb LX,et al. Adherent bacterial colonization in the pathogenesis of osteomyelitis.Science, 1985, 228:990-993.

　　5　Costerton JW,lewandowski Z,Caldwell DE, et al. Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol, 1995,49:711-745.

　　6　Hoyle BD,Jass J,Costerton JW. The biofilm glycocalyx as a resistance factor. J Antimicrob Chemother, 1990,26:473-478.

　　7　Brown MR, Gilbert P. Sensitivity of biofilms to antimicrobial agents. J Appl Bacteriol, 1993,74 Suppl：87-97.

　　8　Evans DJ,Allison DG,Brown MR, et al. Effect of growth-rate on resistance of gram-negative biofilms to cetrimide. J Antimicrob Chemother, 1990, 26:473-478.

　　9　Evans DJ,Brown MR,Allison DG,et al. Susceptibility of bacterial biofilms to tobramycin: role of specific growth rate and phase in the division cycle. J Antimicrob Chemother, 1990, 25:585-591.

　　10　Jensen ET,Kharazmi A,Garred P, et al. Complement activation by pseudomonal aeruginosa biofilms. Microb Pathog, 1993,15:377-388.

　　11　Jensen ET,Kharazmi A,Hoiby N, et al. Some bacterial parameters influencing the neutrophil oxidative burst response to pseudomonas aeruginosa biofilms.APMIS, 1992,100:727-733.

　　12　Davies DG, Chakrabarty AM,Gessey GG. Exopolysaccharide production in biofilms: substratum activation of alginate gene expression by pseudomonas aeruginosa. Appl Environ Microbiol, 1993,59: 1181-1186.

　　13　Yasuda H, Ajiki Y, Koga T. Interaction between clarithromycin and biofilms formed by staphylococcus epidermidis. Antimicrob Agents Chemother, 1994,38:138-141.

　　14　Yasuda H, Ajiki Y,Koga T, et al. Interaction between biofilms formed by pseudomonas aeruginosa and clatithromycin. Antimicrob Agents Chemother, 1993, 37:1749-1755.

　　15　Ichimiya T, Yamasaki T, Nasu M. In vitro effects of antimicrobial agents on pseudomonas aeruginosa bioifilm formation. J Antimicrob Chemother, 1994,34: 331-341.

　　16　Anwar H, Strap JL, Chen K. Dynamic interactions of biofilms of mucoid pseudomonas aeruginosa with tobramycin and piperacillin. Antimicrob Agents Chemother, 1992,36:1208-1214.

　　17　Anwae H,Costerton JW. Enhanced activity of combination of tobramycin and piperacillin for eradication of sessile biofilm cells of pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother, 1990,34:1666-1671.

　　18　Ashby MJ, Neale JE, Knott SJ, et al. Effect of antibiotics on non-growing planktonic cells and biofilms eacherichia coli. J Antimicrob Chemother, 1994, 33:443-452.

克拉霉素对铜绿假单胞菌生物被膜作用的形态学研究

中华结核和呼吸感染 2000年第6期第23卷论著摘要

作者：柏宏坚　何礼贤　瞿介明　胡必杰　王葆青　陈雪华　张杏怡　潘珏

单位：柏宏坚(江苏省盐城市第一人民医院)；何礼贤　瞿介明　胡必杰　王葆青　陈雪华　张杏怡　潘珏(上海医科大学中山医院肺科　200032)

　　生物被膜（BF）是单一或多种细菌粘附于物体或组织表面，增殖形成微定植，并大量分泌胞外多糖（EPS）而形成的一种结构复杂并具有一定功能的膜状结构。发生感染时体内生物材料和组织表面常有细菌BF的存在，这种感染被称为细菌BF相关性感染。BF细菌常对抗生素耐药，使得细菌BF相关性感染的控制十分困难。一些研究证实合并使用大环内酯类(14元环或15元环)抗生素可增强其他抗生素的疗效。有研究认为是大环内酯类抗生素抑制细菌的EPS的产生，增强其它抗生素的渗透性而起协同作用^［1，2］。亦有一些研究持不同的观点^［3，4］。我们通过建立铜绿假单胞菌的BF模型，采用激光共聚焦显微镜（SCLM）和扫描电子显微镜（SEM）从形态学方面观察克拉霉素（CAM）对铜绿假单胞菌BF作用，以期为临床使用克拉霉素辅助治疗BF相关性感染进一步提供实验依据。材料与方法　(1)铜绿假单胞菌由上海中山医院临床微生物中心提供。(2)克拉霉素（美国雅培公司）；(3)胰酶肉汤培养液。(4)PBS缓冲液(pH 7.4)。(5)医用PVC片( NunC公司 )；96孔培养板(NunC公司);(6)扫描电镜(日立S-520型 )；激光共聚焦显微镜(Zessi LSM-510)。采用微量对倍稀释测定CAM对铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度(MIC)，标准质控菌株是铜绿假单胞菌ATCC27853。参照Prosser等^［5］报道的方法加以改进建立成熟BF(8天)模型。将以上成熟铜绿假单胞菌BF分别放置肉汤培养液(对照组)和含有克拉霉素(8 μg/ml)肉汤培养液(30 ml)中，以上培养液每12 h更换1次。分别于2、8、16、24、36 h取出标本用PBS冲洗1次，分别放置无菌培养皿中和置于戊二醛固定液中分送SCLM室直接观察和电镜扫描。SCLM采用放大20倍镜头（H-NA-1.3），激光波长为488 nm的条件下观察。SCLM随机对铜绿假单胞菌BF的3个不同部位测定其BF厚度，并观察CAM作用BF不同时间后其培养液涂片。SEM样品制备：采用常规方法制备SEM样品，然后用SEM观察。结果　(1)CAM MIC测定结果：CAM抑制铜绿假单胞菌所需MIC＞128 μg/ml。(2)SEM观察：成熟铜绿假单胞菌BF中细菌被浓厚的纤维样物质紧密包裹，细菌分布不均、层样重叠。细菌之间以粘稠的纤维相互连接，呈多层网状结构（图1）。SEM观察经CAM处理36 h后成熟铜绿假单胞菌BF的结构完全消失，仅可见BF碎片及浮游状态的铜绿假单胞菌。(3)SCLM观察：可清楚显示成熟BF的基本结构如微定植、隧道、胞外多糖（图2）。CAM处理2 h后成熟铜绿假单胞菌BF的典型隧道结构消失（图3）。经CAM处理8 h后成熟铜绿假单胞菌BF表面明显凹凸不平，呈现碎片脱落的痕迹（图4）。经CAM处理36 h后成熟铜绿假单胞菌BF的结构完全消失，仅见BF碎片,部分细菌呈长杆状，成对或短链排列相互间无粘液物质包裹，细菌长短不一，背景清晰，类似浮游状态的铜绿假单胞菌(图5)。在对照组的培养液以及经CAM处理成熟铜绿假单胞菌BF 2 h时获取培液涂片中，可见浮游状态的铜绿假单胞菌，未见铜绿假单胞菌BF的碎片。经CAM处理成熟铜绿假单胞菌BF 8、16、24、36 h后,在所有培养液涂片中均可见含大量细菌的膜样碎片和浮游状态的铜绿假单胞菌(图6)。(4)作用时间0、2、8、16、24 h标本BF厚度分别为(43.1±1.6)μm、(41.1±1.9) μm、(31.7±1.9) μm(14.2±4.1) μm、(4.9±2.9) μm。0与2 h组BF厚度比较，差异无显著性(P＞0.05)，其他各组之间BF厚度比较，差异有显著性(P＜0.01)。讨论　SEM是常用的观察BF的方法，但因标本需严格的化学固定和脱水，常使其结构遭到破坏。本研究使用的铜绿假单胞菌株，CAM对其MIC是128 μg/ml，研究中使用的CAM浓度为8 μg/ml(1/16 MIC)，对实验菌无抑菌作用。因此，其对成熟铜绿假单胞菌BF的干预作用可能是通过抑菌作用以外的其他机制产生的。本实验发现CAM作用BF 2 h时，BF中典型微定植和隧道结构消失，表明CAM可破坏BF隧道系统，推测这种破坏作用可能会减少BF对渗入BF内的相应抗生素的排泄，增加BF内相应抗生素的浓度，从而在清除BF细菌中产生协同作用。另一方面，随着CAM对BF作用时间的延长，BF结构破坏更加明显，BF逐渐变薄，甚至结构消失，仅见少量碎片和粘附的细菌，同时在含CAM的培养液中可见BF碎片的存在，表明CAM作用于成熟的BF，导致BF裂解，形成碎片，并从表面逐渐脱落，部分形成浮游细菌。CAM破坏已形成的EPS分子结构的确切机制有待进一步深入研究。

图1　成熟铜绿假单胞菌BF电镜扫描图　图2　成熟BF的SCLM水平层面图(距PVC18 μm)，微定植(白箭头)、隧道(黑箭头)　图3　经CAM处理2 h后成熟铜绿假单胞菌BF SCLM水平层面图(距PVC18 μm)　图4　经CAM处理8 h后成熟铜绿假单胞菌BF表面SCLM图像　图5　成熟铜绿假单胞菌BF经CAM处理36 h后SCLM图像　图6　经CAM处理成熟铜绿假单胞菌BF 24 h后其培养液涂片的SCLM图像基金项目：卫生部重症监护室获得性肺炎预防技术系列研究基金资助(43)

　　参考文献1，Kondoh K,Hashiba M,Baba S.Inhibitory activity of clarithromycin on biofilm synthesis with pseudomonas aeruginosa.Acta Otolaryngol，1996,525 Suppl:56-60.2，方向群，刘又宁，陈迁，等.阿奇霉素对生物被膜的抑制及对氟罗沙星的增效作用.中华结核和呼吸杂志，1998，21：538-540.3，Nichols WW,Evans M,Slack ME,et al.The penetration of antibiotics into aggreates of mucoid and non-mucoid pseudomonas aeruginosa.J Gen Microbiol，1989,135:1291-1303.4，Brown ML,Aldrich HC,Gauthier JJ.Relationship between glycocalyx and povidone-iodine resistance in pseudomonas aeruginosa (ATCC27853)biofilms.Appl Environ Microbiol，1995,61:187-193.5，Prosser BT,Taylor D,Dix BA,et al.Method of evaluating effects of antibiotics on bacterial biofilm.Antimicrob Agents Chemother，1987,31:1502.

图片解释---细菌的耐药装置：生物被膜

发表日期：2004年8月30日出处：上海长海医院烧伤科作者：陈玉林

细菌生物被膜（bacterial biofilm）是细菌的重要生存方式，发挥着屏障保护作用。它们对大多数抗菌药物耐药，并且能够逃避机体的免疫攻击，以致在临床上出现诸多难治性感染，给治疗带来难。被膜内细菌又称座生菌（sessil），它不同于游离的浮游菌（planktonic），被膜中细菌的生理状态与其在生物膜结构中的位置有关。位于被膜表层的细菌容易获得氧气与营养，生长活跃，分裂快，菌体大，对抗菌药物敏感。而被膜深层的细菌由于缺乏氧气和营养，生长缓慢，菌体小，甚至成为休眠菌，对外界刺激不敏感，对抗菌药物耐药。深入掌握这些概念，对防治生物被膜相关感染是十分有益的。（编辑：黄伟）

细胞生物膜的研究进展

发布时间02年08月30日 10时33分

北京大学医学部微生物学教研室李彤庄辉

在自然界、某些工业生产环境（如发酵工业和废水处理）以及人和动物的体内外，绝大多数细菌是附着在有生命或无生命物体的表面，以生物膜（biofilm,BF）方式生长，而不是以浮游（planktonic）方式生长。BF是细菌在机体表面形成的高度组织化的多细胞结构，同一菌株的BF细菌和浮游生长细菌具有不同的特性。虽然人类第一次借助显微镜观察的是人牙菌斑BF细菌，但多年来经典细菌学主要是研究浮游生长的细菌，但多年来经典细菌学主要是研究浮游生长的细菌，而忽视了对BF细菌的研究。随着对细菌致病机制的深入了解，发现BF细菌对抗生素和宿主免疫防御机制的抗性很强，从而导致严重的临床问题，尤其是慢性和难治的感染性疾病，因此，开始重视对BF的研究。20世纪30年代中期，Gibbons和van Houte等对牙菌斑BF细菌和龋病的关系做了大量研究，为深入了解BF细菌在健康和疾病中的作用奠定了基础。现在已知，细菌可在人体组织如牙齿、牙龈、皮肤、肺、尿道及其他器官的表面形成BF，引起诸如牙周病、龋齿、慢性支气管炎、败血病、血栓性静脉炎、难治性肺部感染和心内膜炎等疾病。在血液、组织液和淋巴液等体液中一般不形成BF。但由于这些体液含有适合细菌生长的有机营养成分，因此，当体液中含有细菌时，这些细菌可在人体内人工医疗装置（如隐型眼镜、人工关节和心脏人工瓣膜）等无生命物体的表面形成BF。此外，BF细菌还可污染与人类生活相关的设施，如空调系统、供水系统和食品加工设备等，由此造成传染病的流行。据估计，大约65%人类细菌性感染是由BF细菌引起的。 BF研究涉及微生物学、免疫学、分子生物学、材料科学和数学等多学科，其真正作为一个独立学科发展起来始于20世纪70年末。90年代后，随着相关学科的发展及对BF细菌在医学上重要性的认识，BF研究得到迅速发展。1990年，蒙大拿州立大学建立了世界上第一个生物膜工程中心。近几年，美国国立卫生研究所（NIH）也为此投入大量研究资金。目前，国内外越来越多的学者从事BF研究，以期了解BF形成的分子机制、生理生化特点及其调控机理等，其目的为控制BF的相关感染。一、细菌生物膜的特点细菌生物膜（BF）,国内也有学者译为生物被膜，是指附着于有生命或无生命物体表面被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌群体。BF中水份含量可高达97%。除了水和细菌外，BF还可含有细菌分泌的大分子多聚物、吸附的营养物质和代谢产物及细菌裂解产物等。因此，BF中存在各种主要的生物大分子如蛋白质、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、脂和磷脂等物质。 BF多细胞结构的形成是一个动态过程，包括细菌起始粘附、BF发展和成熟等阶段，BF细菌在各阶段具有不同的生理生化特性。（一）细菌粘附：细菌对宿主表面的粘附是细菌在宿主体内形成BF的第一步。这种粘附作用主要是细菌表面特定的粘附素蛋白（adhesin）识别宿主表面受体（receptor）的结果，因此具有选择性和特异性。宿主组织表面的蛋白、糖蛋白和糖脂常可作为受体，而选择性地吸附特定种类的细菌。细菌粘附于表面可免于被流体带到不利于其生长的环境，例如，生长在尿道中的大肠杆菌具有高度进化的表面结构，牢固地附着在尿道内，免于被尿液冲出体外。细菌可很快发生粘附，便如，内氏放线菌（Actinomyces naeslundii）对附着在羟基磷灰石小球上的酸性富含脯氨酸的蛋白粘附，约1小时吸附即趋于饱和。在细菌粘附阶段，由于缺乏成熟的BF结构保护，细菌的抗性不强，因此，抗菌药物的疗效相对较好。（二）BF的发展：细菌粘附到表面后，即调整其基因表达，在生长繁殖的同时分泌大量胞外多糖（exopolysaccharide, EPS）。EPS可粘结单个细菌而形成细菌团块，即微菌落（microcolony）。大量微菌落使BF加厚，因此，EPS分子的产生对BF结构的发展十分重要。在此阶段，除观察到EPS合成的增加外，也经常观察到细菌对抗生素抗性的提高。另外，还伴有诸如增加对紫外线的抗性、遗传交换效率、降解大分子物质的能力以及增加二级代谢产物的产率等特性的改变。变化是细菌为适应自然环境而采取的生存策略，但正是BF细菌的这些特性导致了严重的临床问题。（三）BF的成熟：成熟的BF形成高度有组织的结构，利用激光共聚焦显微镜（confocal scanning laser microscope, CSLM）观察到成熟BF结构是不均匀的，即具有不均质性（heterogeneity），它是由类似蘑菇形状的微菌落组成的，在这些微菌落之间围绕着输水通道，可以运送养料、酶、代谢产物和排出废物等。因此，有人将成熟的BF内部结构比喻为原始的循环系统。当细菌在增殖时可因菌种、营养、附着的表面和环境条件不同，形成疏松或致密以及厚薄不等的BF结构。在BF成熟过程中，除了与上述EPS的产生有关外，细菌的密度感应系统（quorum sesing system）起重要作用。例如，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的密度系统突变株，与野生菌相比，其形成的BF较薄，缺少复杂的结构，且抗性较差。细菌密度感应系统是细菌通过监测其群体的细胞密度来调节其特定的基因表达，以保证BF中营养物质的运输和废物的排出，避免细菌过度生长而造成空间和营养物质缺乏。革兰阴性细菌的密度感应系统大多是利用N-酰基高丝氨酸内酯（N-acyl homoserine lactones, AHL）作为信号分子，AHL浓度随细菌密度的增加而上升，当AHL达到一个阈值时，可与一种转录激活子结合而激活，AHL和转录激活子复合物进一步诱导靶基因的表达。成熟的BF 内在的调节机制或在外部冲刷力等作用下可部分脱落，脱落的细菌又转变成浮游生长状态，可再粘附到合适的表面形成新的BF。由于BF的形成是一个动态过程，且结构上存在不均质性，因此，BF中的细菌是在不同时间和空间发展的，其基因表达和生理活性也具有不均质性。BF垂直方向不同层面的细菌RNA含量、呼吸活性和蛋白质合成均不同。同时由于细菌所处微环境的PH和氧化还原电位等不同，可使遗传学上一致的细菌个体表现不同的特性，如产生毒素不同可使BF中一些细菌个体对宿主无危害，而另一些细菌则可能对宿主有致命威胁。因此，不均质性是细菌BF的另一个重要特性，也与细菌的抗性有关。从理论上讲，BF是细菌在表面生活时采取的生长方式，这是细菌的一种本能，任何细菌均可形成BF。但是，当细菌的一种本能，任何细菌均可形成BF。但是，当细菌发生遗传改变时，可影响其形成BF的能力，并有可能影响其致病性。有些细菌的毒力因子（如菌毛等）与形成BF能力有关，则其毒力强弱可影响其BF的形成。具体到某一菌株能否形成BF，是与环境信号有关的。环境信号包括营养成分、温度、渗透压、pH、铁离子浓度和氧化还原电位等，其中营养成分对BF的形成起重要作用。例如，铜绿假单胞菌和荧光假单胞菌几乎可在任何右以生长的条件下形成BF，大肠杆菌（Escherichia coli）K-12和霍乱弧菌（Vibrio cholerae）的一些菌株在基础培养基条件下不能形成BF，但是，大肠杆菌0517：H7只在低营养培养基条件下形成BF。如菌株是由表面分离的，一般该菌株具有形成BF的能力。不是由表面分离的菌株，可用微量反应板方法测定其形成BF的能力，其基本步骤是在微量反应板的孔中培养细菌，形成的BF将吸附于孔壁，洗掉浮游细菌后，用结晶紫染色法观察是否形成BF。 BF可由纯菌种形成，也可由多菌种组成。在多菌种BF中，不同菌种在不同的时间和空间发展，存在着菌种的交替演变。牙菌斑是典型菌种BF，革兰阳性链球菌（Streptococcus）和放线菌是牙菌斑BF中早期定植菌种，它们的粘附表面受体，例如，梭杆菌（Fuso-bacterium）可通过共凝集作用（coaggregation）粘附到链球菌和放线菌上面。另外，链球菌和放线菌的代谢造成局部微环境改变（氧化还原电位和pH等）也为新菌种的演变创造了条件，例如，一些兼性厌氧菌的生长消耗氧气，从而创造了厌氧微环境，使绝对厌氧梭杆菌有可能在口腔这一开放环境中得以定植生存。因此，多菌种BF扩大了细菌的生存环境。二、生物膜细菌致病的机制 (一) 抗生素抗性：与浮游细菌相比，BF细菌对抗生素的抗性可提高10-1000倍。BF细菌抗药性主要取决于其多细胞结构：（1）BF中的EPS起屏障作用，限制抗生素分子向细菌细胞运输。多糖蛋白复合物还可与一些药物反应，具有中和药物的活性；（2）BF中微环境的不同可影响抗生素的活性，如局部酸性代谢产物的积累对许多抗生素的活性有拮抗作用。厌氧微环境可严重影响氨基糖苷类抗生素的活性等。此外，营养的消耗或抑制性代谢产物的积累可使一些细菌生长缓慢或停止分裂，这类细菌一般对抗生素敏感性差。在此，BF结构的不均质和BF细菌生理上的不均质性渗入的药物只能杀死一部分细菌，而另一部分细菌则存活下来；（3）表面生长可诱导细菌表达与浮游细菌不同的基因，诱导产生BF特异性表型。例如BF中的一部分细菌可进入一种类似牙孢菌的分化状态，其对抗生素有高度抗性；（4）多菌种BF中各菌种的协同作用。例如，产生β-内酰胺酶的菌种可保不产生此酶的菌种免受青霉素的作用。（二）对抗机体免疫防御：BF细菌可利用多种方式对抗机体免疫防御机制：（1）减少细胞因子（cytokine）的产生或酶解细胞因子。例如，表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）浮游细胞刺激人血淋巴细胞产生的γ干扰素量是BF细胞的8-16倍；（2）抵抗单核巨噬细胞的趋化作用；（4）BF细菌可刺激机体产生抗体，但这些抗体不仅难以灭杀BF内部的细菌，而且可在BF表面形成免疫复合物，损伤周围的机体组织；（5）BF诱导的补体转化和中性粒细胞呼吸明显下降。值得指出的是，一种BF抗药或抗体机体免疫防御的机制不是单一的，往往有多个机制共同起作用。另外，不同菌种的抗性机制也不尽相同。三、生物膜相关感染的控制常用抗生素疗法对细菌BF引起的感染疗效欠佳。随着细菌耐药因子的传播，传统抗生素的疗效更为有限。在这种情况下，细菌BF的研究为抗细菌性感染特别是难治慢性感染提供了崭新的途径。（一）从细菌BF中鉴定新的抗生素物质，发展新型抗生素类药物。新药的设计目标是破坏BF的形成，因此，凡是与BF的动态变化和结构形成有关的分子转化、代谢活性和信号传导过程，均可作为新药研制的目标。1999年Schneewind研究组在革兰阳性菌金黄色葡萄球菌（S.aureus）中发现了一种转肽酶（sortase）,它与表面蛋白的分泌定位有关。该酶缺陷株不能表达表面蛋白，从而大大减弱对宿主的粘附性和致病性。转肽酶基因几乎存在于所有革兰阳性细菌中，因此，它是一种很有价值的新药目标，能抑制转肽酶形成的药物预计能有效预防革兰阳性细菌引起的感染。EPS和细菌密度感应系统等均可作为筛选新药的目标，新药可干扰EPS和AHL信号的合成，或降解已形成的EPS和AHL。其特点是不杀死细菌，而只是破坏细菌在宿主体内的粘附、定植和形成保护性的BF，这样细菌发展抗药性的环境压力较弱，因此不易产生抗药性。（二）研究人体健康微生物BF的组成及其与宿主和睦相处的分子机制，发展新型抗感染微生态制剂。值得指出的是，并非所有BF都是有害的，人体带有大量正常微生物，与人类健康息息相关。新型抗感染微生态制剂将着眼于增进有益的正常微生物BF活性，通过竞争营养、空间和产生微生物拮抗物质，特异性抑制病原菌的粘附、定植和在生物膜中的代谢，克服由于传统抗生素的使用所引起的下常菌群失调、真菌二次感染和抗生素抗性等问题。目前，国内外开发的微生态制剂主要有三类：即益生菌（probiotics）,如双歧杆菌和乳酸杆菌等；益生元（prebiotics），即益生菌和益生元同时并用的生态制剂。（三）发展抗细菌粘附的生物材料，预防BF污染各种临床应用的导管、插管和医用合成材料。表层镀银的合成材料可预防BF污染心脏人工瓣膜和导尿管等ge面镀钛的人工声带可防止假丝酵母（Candida）污染。（四）对现已应用的抗生素，研究其尚未被发现的抗BF特性和新药的治疗方案。据报道，联合使用抗生素效果良好。Yamasaki等发现罗红霉素和亚胺硫霉素合用能有效杀灭金黄色葡萄球菌BF，其机制与增强多形核白细胞和巨噬细胞对BF的渗透有关。罗红霉素和氟罗沙星对铜绿假单胞菌BF有明显抑制作用，两者合用可治疗由铜绿假单胞菌BF引起的难治性感染，其中罗红霉素通过抑制细菌多糖蛋白复合物合成来增强氟罗沙星对BF的渗透，对氟罗沙星杀灭BF中细菌起增效作用。目前应用的抗生素主要是通过测定其杀菌或抑菌活性筛选获得的，但有必要应用新的筛选标准，如抗细菌粘附等，重新判定已知抗生素的抗BF活性。总之，BF的研究使微生物学的发展迈出了重要一步，即认识到微生物可以以多细胞的生命形式存在，具有比以往所理解的更为复杂的生命活动。同时，这一领域的研究将大大丰富人类控制细菌性感染的手段。当前，各种先进的生物技术被用于BF的研究，例如，利用激光共聚显微镜和原子力显微镜研究BF的结构和动态变化；利用报告基因和荧光探针了解BF中的基因表达；利用基因芯片和双向电泳技术比较BF细菌和浮游细菌基因表达和蛋白组成的区别等。可以预见，随着BF研究的深入，人类将能更好地控制细菌性感染。

　　　　　　　　　　　　　　　　摘自：《中华微生物学和免疫学杂志》2002年5月第22卷第3期

细菌生物被膜与耐药性

P. 14 作者:Mary Ann Jabra-Rizk, William A. Falkler等

念珠菌种,包括新发现的引起杜波阿脓肿的机会性病原体念珠菌,正成为医源性感染的主要原因。这种病菌感染的表现常伴随细菌生物被膜的形成，包括在医疗工具上，如血管导管。因为抗药性的问题，常规的治疗方法对形成细菌生物被膜的念珠菌感染通常效果不佳。这种抗药性可能部分归结于表面药物溢出泵的调节作用。细菌生物被膜生成时念珠菌显示对现有的常规抗真菌药物有抗药性。新型抗真菌药物，两性霉素和ethinocandin显示出对这类念珠菌感染的独特的抑菌作用。这一发现为治疗危及生命的全身性真菌病带来的突破。如果能够使用药物有效治疗形成细菌生物被膜的念珠菌感染，会导致治疗真菌感染方面的重大进展。

重视细菌耐药性

自20世纪70年代以来，细菌耐药性的问题在世界范围内日趋严重。在2002年中国药学会学术年会的抗生素专业分会场，与会专家从两个角度关注了这个问题，呼吁重视细菌耐药性。　　中国人民解放军总医院临床药理室王睿教授：细菌生物被膜的耐药屏蔽　　王教授介绍，细菌产生耐药性的原因有多种，包括产生钝化酶、细胞膜结构和通透性发生改变、产生代谢物、发生突变和形成生物被膜等。其中，细菌生物被膜（BBF）是细菌产生耐药性的重要原因之一。　　BBF系细菌为适应自然环境有利于生存而特有的生命现象，它是指细菌吸附于惰性物体如生物医学材料或机体黏膜表面后，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等多糖蛋白复合物，使细菌相互粘连并将其自身克隆聚集缠绕其中形成的膜样物。现在医学材料和许多慢性细菌感染性疾病的器官组织表面均发现了BBF存在。BBF内细菌无论是形态结构、生理生化特征等与普通浮游生长细菌均有显著不同，对多种抗菌药物显示了严重耐药性，常导致抗感染治疗失败。　　在BBF相关感染疾病的病灶中，细菌一部分以浮游生长的形态存在，另一部分则以BBF的形式存在，有效浓度的抗菌药物能迅速杀灭浮游生长的细菌和BBF表面的细菌。但是BBF细菌产生的藻酸盐，一方面可以通过氢键、范德华力、共价键吸附一部分抗菌药物，另一方面吸附于BBF藻酸盐的抗菌药物灭活酶如β－内酰胺酶也可灭活一部分抗菌药物，这样就使到达BBF深处直接接触细菌的抗菌药物大大减少。BBF内细菌分裂迟缓，对抗菌药物不敏感。此外，体外实验表明，细菌形成BBF后可逃避机体的免疫作用，表现在细菌形成BBF后，由它诱导的补体转化及中性粒细胞呼吸爆发反应显著降低，从而可能产生免疫逃逸作用，使细菌不易被清除。　　关于BBF的耐药机理，现在还不十分明确，一般认为与BBF内细菌的生理状态和BBF渗透屏障有关。这就导致BBF相关感染疾病的治疗非常棘手。王教授说，目前主要通过抑制BBF形成和对已形成稳态的BBF，用能通过BBF的杀菌剂来进行防治。　　在BBF形成的初期，可应用敏感抗菌药物治疗。早期应用大剂量或渗透性较强的抗菌药物，如氟喹诺酮类药物可穿透胞外多糖，对生长缓慢的细菌有一定的杀伤作用，但不能完全清除BBF内的细菌。大环内酯类药物，可抑制BBF主要成分多糖蛋白复合物合成酶、多糖蛋白复合物形成，破坏BBF结构，促进其他抗菌药物渗透，因此可将小剂量大环内酯类药物与对感染菌敏感的药物合用来治疗BBF相关感染。大环内酯类药物与氟喹诺酮类药物联用，可抑制BBF的形成，提高后者对BBF的渗透性和对BBF内细菌的杀灭活性。　　用藻酸盐单克隆抗体进行治疗是一种很有前途的方法，目前关于藻酸盐单克隆抗体的研究处于体外试验阶段。国外研究发现，藻酸盐单克隆抗体可降低细菌的粘附性，与抗菌药物联用，可治疗BBF相关感染，同时还发现，抗菌药物－藻酸盐单克隆抗体与抗菌药物－藻酸盐裂解酶有协同作用及可逆转藻酸盐对淋巴细胞和中性粒细胞吞噬功能的抑制作用，可增加抗生素对BBF的渗透性，产生协同作用来降低BBF相关感染的发生率。　　生物医学材料相关感染是发病率、死亡率、治疗费用较高的院内感染，如何预防生物医学材料相关感染成为目前面临的严峻课题。生物医学材料的质地与BBF相关感染的发生有密切关系。通过改变生物医学材料的质地，可减少致病菌的粘附。研究表明，生物医学材料的表面能在20～30达因／平方厘米时，能增强抑制细菌、真菌生长的能力。因此，选用低表面能的材料如特富龙、高弹力硅胶等，可降低BBF相关感染的发生率。镀银或涂布有洗必泰／磺胺嘧啶银的生物材料对细菌的粘附更有抑制作用。　　上海来益生物药物研究开发中心陈代杰教授：兽用抗菌药物与细菌耐药性　　上海来益生物药物研究开发中心的陈代杰教授从兽用抗菌药物方面谈了细菌耐药性的问题。陈教授指出，很多抗菌药物在医院外不仅用于人体，同时也被广泛用于动物。动物使用抗菌药物，一是治疗和预防细菌感染性疾病。二是作为饲料添加剂，以提高饲料利用率和加快动物生长。由于动物生长促进剂（AGP）在动物中被大量地使用，造成人畜细菌的交*耐药性。　　西班牙对弯曲杆菌的调查结果表明，弯曲杆菌对各种抗菌药物的耐药率的增加，与抗菌药物作为AGP使用直接有正相关性。　　新西兰南部肠球菌的调查研究结果表明：动物虽然仅用阿伏帕星作为AGP，但它作为糖肽类抗菌药物，与万古霉素具有交*耐药性，虽然受试人群从未用过阿伏帕星，但由于传递获得了阿伏帕星耐药性，因而对万古霉素也产生了耐药性。火鸡、火鸡饲养员、火鸡屠宰人员和附近居民粪便的万古霉素耐药菌的分离率都非常高，且这些人员从未使用过万古霉素。说明耐药基因是通过动物传递给人的。　　由于大剂量使用抗生素，有可能增加病原微生物的耐药性。1986年瑞士禁止使用抗生素作为饲料添加剂，欧洲其他国家对此进行了广泛争论；1997年4月，欧盟仍禁止使用阿伏霉素作为饲料添加剂。同时，欧盟禁止使用硫酸泰乐菌素、维吉尼亚霉素、杆菌肽和螺旋霉素。此外还将进一步禁止使用喹氧甲酷和卡巴氧。此后，其他国家也纷纷效仿。　　世界卫生组织于2000年在日内瓦召开会议，提出终止或尽快结束使用与目前临床应用相同结构类型的抗菌药物作为AGP。因此，人们必须开辟新的途径，来保护并提高畜禽健康、维持较高的生产性能，提高营养物质的利用率。　　对于国内现状，陈教授谈到，国内目前使用抗菌药物作为AGP非常普遍，且从法律法规上还没有适当的规定。而且国内对由于动物滥用抗菌药物而引起的细菌耐药性，至今尚未引起足够的重视，几乎还没有有关的研究文章。因此，建议政府有关部门像对医院耐药菌的检测那样，成立相关的监测机构，专门从事动物细菌耐药性的研究。他还建议，在还没有政府支持的情况下，国内有关研究机构应该领先进行一些这方面的研究工作。

主题：细菌生物被膜相关感染的特点与防治